HIV抗体初筛实验

HIV-1抗体检测包括HIV-1抗体初筛和HIV-抗体确认两部分。初筛检测通常由取得资格的HIV-1抗体初筛实验室和／或确认实验室中进行，HIV-1抗体确认和HIV-1抗体阳性报告必须由取得资格的确认实验室进行。

方法和原理：酶联免疫吸附试验(Ezyme linked immunosorbentassay，ELISA)简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术，其基本方法分三类：间接法、双抗原夹心法和抗体竞争法。

各厂生产的不同原理ELISA法HIV检测试剂盒的试验方法和操作步骤基本相同，只是在作用时间、标记酶的种类、反应底物、样本加量等方面有所差异。

初筛检测的几个问题

1.初筛检测的阳性结果不是最终结论，不能通知受检者本人及其他人员，样本需经该试剂和另一种试剂复检，如仍为阳性，应及时送实验室进行确认；
　

2.初筛检测的宗旨是避免漏检，因此应选用敏感性高的符合国家要求的高质量试剂，且必须为HIV-1/2混合型；
　

3.各单位可根据不同目的、检测对象、人群流行率、成本-效益、实验室设备和技术水平等选择不同初筛实验方法；
　

4.交叉反应性或假阳性反应：某些病毒如CMV、EBV等，寄生虫如疟原虫的部分抗原性物质和某些自身免疫病患者，如系统性红斑狼疮和风湿病者体内的自身抗体与HIV-1的某些抗原决定簇有交叉反应性，在初筛检测时可能导致假阳性现象。此种情况下，样本OD值与临界值的比值通常为1—1.2，对这种结果除应排除HIV-1的早期感染，或感染HIV-2，HIV-1“O”亚型的可能外，还应注意假阳性，以及实验操作过程中的技术误差；
　

5.不同厂家及同一厂家生产的不同批次试剂的敏感性和特异性可能存在一定差异，各实验室最好应用标准质控血清对新购试剂及在每次检测时进行质量控制和质量评价，以确保检测工作结果的准确可靠性。

HIV抗体确认实验

根据卫生部规定，HIV-1抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的HIV抗体确认实验室出具才有法律效应。

最常用的HIV-1抗体确认实验方法是免疫印迹法（Wwstern Blot,WB）和条带免疫印迹法（Strip Immunoblot Assay, SIA或Linear Immunoblot Assay, LIA）,其中以WB法最常用。

免疫印迹实验：用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原，也是目前国内HIV抗体确认的首选方法，他能同时检测不同HIV-1抗原组分的抗体，因此能够鉴别或肯定初筛检测的结果。　

条带免疫印迹法：工作原理和操作方法与WB实验基本相同，只是条膜上抗原来源和组成有所区别。检测时信噪比高，本地清晰，无潜在假阳性干扰，且可通过调整条膜上HIV抗原量，克服了WB实验中使用病毒裂解产物而可能产生的固相载体上某些重要抗原量不足的缺点。这类试剂特异性很高，但也可能由于病毒株在所合成抗原决定簇部位发生突变导致HIV抗体假阴性结果；另一个缺点是由于合成抗原不能糖基化，其立体构像与天然抗原分子有一定差异，在一定程度上可能影响了模拟真实HIV抗原检测抗体的能力。

HIV-1抗体确认实验结果的评价 免疫印迹实验的结果是根据硝酸纤维素条膜特异性HIV抗原位置上出现的带型不同来判断HIV抗体为阳性、阴性和不确定。

阳性和阴性结果的判断标准：美国CDC的标准为国际公认。

阳性和阴性结果的判断标准

HIV抗体不确定（或可疑）结果的评价 在某些情况下，样品显示不典型的HIV反应性条带图谱，既不能确定为阳性也不能确定为阴性，称为HIV抗体不确定或可疑阳性。

以下原因可能导致HIV-1抗体不确定结果的出现：①HIV-1急性感染后，抗体刚出现，仅显示gp160或120，或P24，P31，P55带；此时ELISA往往已显示阳性反应；②非特异反应，如在高丙球蛋白血症，某些病毒性疾病和寄生虫感染，自身免疫性疾病等情况下可出现该现象；③极少数晚期艾滋病患者；④与HIV裂解物中的宿主细胞成分发生交叉反应；⑤样本交叉污染。

对HIV抗体不确定的受检者必须进行随访，通常为每3个月1次，共随访2次。如随访过程中出现特异性HIV抗体反应条带如gp160或120，则做出HIV-1抗体阳性结论。如随访6个月后带型消失或没有变化，则做出HIV抗体阴性报告。

艾滋病毒载量的检测及其意义

在HIV的各种检测中，其中一项为病毒水平定量检测。它包括HIV-1 p24抗原定量检测、血浆/淋巴细胞中病毒培养定量检测、血浆中病毒RNA定量检测及淋巴细胞cDNA定量检测。其中较为敏感、准确的方法应为血浆中病毒RNA定量检测法。

它可以准确的测定出每毫升血浆中HIV RNA的含量。

自90年代初，血液中HIV RNA的定量检测已被公认为可以预估病人病程，并可利用于鸡尾酒疗法的效应的评估。利用病毒载量可在病人急性感染期间，处于空窗期时即可检测出高水平的病毒RNA含量。医师可利用结果判定病人疾病的进程和进展，以及可在接受抗病毒治疗过程中起监测与指导作用。可以在开始治疗前对病人进行HIV RNA水平检测，治疗过程中通过对HIV RNA的一系列测定来指导治疗。例如，如果RNA水平没有降低，那么就应该调整治疗或改变治疗方案；如果RNA复制受到抑制，那么就应持续治疗。

病毒载量检测主要有三种方法：bDNA、RT-PCR及NASBA。bDNA是一种核酸检测技术，它属于信号扩增，而RT-PCR及NASBA则属于靶扩增。bDNA检测中，靶探针是与HIV基因组中的pol基因序列特异性结合，此段序列为所有已知的HIV基因中最保守的区域。RT-PCR检测是通过逆转录(RT)及扩增(PCR)完成特异性扩增HIV gag基因的一段长为142bp的基因序列。由于每个样本中QS的量已知，在扩增及检测后可通过对光密度结果的比较，运用公式计算出HIVRNA拷贝数，从而达到HIV RNA定量的目的。NASBA检测是通过核酸释放、提取(固相提取)，核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测(ECL检测)来完成对血浆/血清中HIV病毒RNA的定量测定。RT-PCR、NASBA检测属于PCR方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以较容易受污染，而使RNA降解。bDNA与RT-PCR、NASBA相比较有较好的稳定性、线性和可重复性。

血浆中HIV RNA的定量分析，可表现出病毒复制动力学，也反应血浆中游离病毒的浓度，是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果，因而在判定疾病进程和判定临床治疗效果上具有极大的价值。